por Víctor Hugo Tomasi

Las mezclas fijadoras son combinaciones de dos o más sustancias químicas con propiedades fijadoras del tejido y cuya finalidad es compensar las desventajas de una de esas sustancias con las ventajas de las otras. Así por ejemplo, las fibras colágenas presentan cantidades importantes de lisina e hidroxiprolina y se fijan adecuadamente con formol, vía puentes hidrógeno. Sin embargo, las queratinas, que contienen fundamentalmente cisteína, se fijan con dificultad. A fin de preservar ambas proteínas, el formol al 10% acuoso se debe adicionar con bicloruro de mercurio, ya que este metal bivalente (Hg++) se une con elevada afinidad a los grupos sulfhidrilados de la cisteína.


Generalmente, las sustancias que componen una mezcla fijadora deben presentar compatibilidad química, a fin de que no se produzcan precipitados insolubles en dicha mezcla. Las proporciones de cada droga deben ser adecuadas, ya que podrían reaccionar entre sí originando otros compuestos que no tienen propiedades fijadoras o que podrían provocar una acción injuriosa sobre el tejido en general o alguno de sus componentes.

En bibliografía se informan diferentes fórmulas fijadoras, las cuales pueden ser acuosas o alcohólicas, con o sin formol y se recomiendan según el objeto de estudio. A continuación se describe un grupo selecto de ellas y que son de uso corriente en nuestro laboratorio:

Líquido de Clarke (1851): se utiliza en citología exfoliativa. Provoca buena fijación de ácidos nucleicos y es muy empleada para la impregnación argéntica de NOR. Si se desea colorear el ARN con la técnica de Brachet (verde de metil-pironina) se debe agregar 30 ml de cloroformo por cada 70 ml de solución stock.

Etanol absoluto 60 ml
Acido acético 20 ml

Líquido de Zenker (1884): se la puede emplear para la preservación de componentes ricos en sangre y para la realización de métodos tricrómicos y coloración de miofilamentos. En el momento de usar de debe agregar 5 ml de ácido acético glacial por cada 95 ml de la solución stock.

Cloruro de mercurio 12.5 gr
Dicromato de potasio 6.3 gr
Sulfato de sodio 2.5 gr
Agua destilada 250 ml

Líquido de Carnoy (1887): fórmula que penetra muy rápidamente y tiene aplicación en citología para la coloración de ácidos nucleicos. También preserva glucógeno. Tiende a destruir micobacterias.

Etanol absoluto 60 ml
Cloroformo 30 ml
Acido acético 10 ml

Líquido de Bouin (1897): muy utilizado en histología embriológica y para órganos genitales. Asimismo, se lo recomienda cuando se desea colorear con cualquier técnica tricrómica para la diferenciación de tejido muscular y conectivo. Las muestras se deben lavar con etanol a 70º.

Acido pícrico 150 ml
(Solución acuosa saturada)
Formaldehído 50 ml
Acido acético glacial 10 ml

Líquido de Helly (1903): es recomendado para médula ósea, tejido hematopoyéticos y estudios de discos intercalares. En el momento de usar de debe agregar 5 ml de formol puro por cada 95 ml de solución stock.

Cloruro de mercurio 12.5 gr
Dicromato de potasio 6.3 gr
Sulfato de sodio 2.5 gr
Agua destilada 250 ml

Líquido de Karnovsky (1946): se utiliza especialmente para la fijación de muestras destinadas al estudio con microscopio electrónico.

Formaldehído al 10% 20 ml
Glutaraldehído al 25% 10 ml
Cacodilato de sodio 0.2M 70 ml

Líquido de Lewitsky (1958): esta mezcla permite la preservación de depósitos grasos de tejidos animales y, en especial, de vegetales. En nuestro laboratorio se lo utiliza con el mismo propósito en tejidos embrionarios con muy buenos resultados de fijación.

Acido crómico al 1% 50 ml
Formol al 10% 50 ml

Líquido FAA (1911): esta mezcla es utilizada por los botánicos para la fijación de muestras vegetales. La concentración de alcohol es mayor debido a que los vegetales presentan gran cantidad de carbohidratos en su composición macromolecular (celulosa y hemicelulosa).

Etanol al 50% 67 ml
Acido acético glacial 17 ml
Formaldehído puro 16 ml



Líquido de Gendre (1937): constituye una variante de la mezcla de Bouin y se la emplea con muy buenos resultados para la fijación de Glucógeno. Tras fijar, las muestras se deben lavar con varios baños de etanol al 70º.

Acido pícrico 80 ml
(Solución etanólica saturada)
Formaldehído puro 15 ml
Acido Acético glacial 5 ml

Líquido de Lillie o B-5 (1965): se emplea para la fijación de médula ósea, nódulos linfáticos y otros tejidos hematopoyéticos. En el momento de usar se debe agregar 5 ml de formol puro por cada 50 ml de solución stock.

Cloruro de mercurio 12 gr
Acetato de sodio 2.5 ml
Agua destilada 200 ml



Líquido Anatech Ltd. o Formol-zinc (1988): esta mezcla no tamponada es un excelente fijador para inmunohistoquímica. La solución tamponada se prepara agregando 1.6 gr de cloruro de zinc a 1000 ml de Formol-PBS pH 7,2.

Formaldehído 100 ml
Cloruro de sodio 4.5 gr
Sulfato de zinc 1.6 gr
Agua destilada 900 ml



Lavado de las Muestras Fijadas: Una vez que las muestras biológicas han permanecido en el reactivo fijador el tiempo suficiente, se deben retirar del mismo y se procede al lavado en abundante líquido, con el propósito de eliminar los restos del agente fijador. Una acción muy prolongada en estos reactivos podría perjudicar, en términos generales, la coloración ulterior de los cortes, incluso alterar la estructura del tejido por maceración. De esta manera, se debe considerar que cuando los especímenes se fijan con óxidos de osmio o cromo para grasas se deben lavar con agua común durante 24 horas; mientras que las fijadas con ácido pícrico se deben colocar en etanol a 70º hasta que las piezas biológicas no liberen más ácido. Los cortes histológicos de muestras que han sido fijadas con sales de mercurio se deben deszenkerificar con lugol y luego lavar con tiosulfato de sodio, a fin de eliminar este metal bivalente que produce leucocompuestos en los métodos de tinción de rutina.
Cuando las muestras están destinadas a estudios de biología molecular, tales como hibridación in situ, PCR in situ, detección de apoptosis (técnica TUNEL o Annexin V, Bcl-Bax, Caspase 3), inmunohistoquímicos, y son fijadas con reactivos aldehídicos (formol, glutaraldehído, glioxal), los cortes se deben lavar con soluciones buffer a pH 7.2, a fin de eliminar el fijador y preservar los sitios químicos del tejidos que han de reaccionar con los reactivos correspondientes. Asimismo, las muestras fijadas con etanol, metanol o acetona, los cortes se deben lavar con soluciones buffer. Los especímenes destinados a microscopía electrónica y fijados con mezcla de Karnovsky se deben lavar con varios baños de buffer cacodilato de sodio y luego con agua destilada, a fin de evitar precipitados del osmio que se utiliza durante la posfijación.
Se recomienda que las muestras de tejido nervioso fijadas en formol para la realización de métodos argénticos, deban lavarse con agua común adicionada con unas gotas de piridina o amoníaco. Sin embargo, he observado que los resultados obtenidos con impregnaciones argénticas de tejido nervioso fueron satisfactorios sin el agregado de estas sustancias.

Resultados e Interpretación de la Fijación: En todo proceso de fijación es indispensable saber juzgar críticamente la calidad de los resultados obtenidos. Para la correcta preservación de las estructuras es fundamental que las relaciones espaciales de los diferentes componentes del tejido no se modifiquen. Así por ejemplo, un trombo debe permanecer adherido a la pared del vaso o una costra a la piel. Estos componentes tisulares difícilmente se desprenderán si la fijación se hizo adecuadamente.
Uno de los cambios más frecuentes que ocurren durante la fijación son las dehiscencias de los tejidos, que, por lo general, se producen por cambios rápidos y evidentes en la posición relativa de unas zonas respecto a otras. Esto sucede, por ejemplo, entre un tejido denso, con bajo contenido en agua y otro menos compacto rico en agua, tal como sucede entre la capa muscular y la submucosa del intestino. Aquí es común que durante la fijación se produzca una dehiscencia que separa casi completamente ambas capas. Esto es debido a que el grado de contracción de los tejidos producido por el fijador es distinto en cada uno.
Si las fuerzas que tienden a disociar estos tejidos son considerables, aparecen pequeñas grietas tisulares dando lugar a espacios tan reducidos que pueden inducir a error y ser considerados como auténticos componentes del tejido. Un caso particular suele observarse debajo de los epitelios, donde se originan espacios artificiales y que fueron considerados durante largo tiempo como algo real. Por el contrario, durante mucho tiempo se discutió sobre el carácter artificial de los espacios de Disse en el hígado y de los espacios de Virchow-Robin en el cerebro.
En muchas ocasiones, los cambios de volumen de los tejidos provocados por acción del fijador se producen de manera uniforme; sin embargo, en otras, de forma irregular. La calidad de una imagen microscópica se considera buena, si la información que proporciona el corte histológico concuerda con la naturaleza real del tejido en estudio. Para ello, es indispensable ajustarse siempre a las mismas pautas de trabajo, que permitan lograr uniformidad y reproducibilidad de imágenes histológicas para llegar a un diagnóstico valedero.

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